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制备多肽色谱柱有哪些留意事变

作者:andy       公布>###nbsp;     

剖析色谱比力罕见的吸附剂颗粒直径为5μm,制备色谱常常利用的吸附剂颗粒直径愈加大。分外是加样量凌驾样品存储量时(柱过载),柱效与剖析色谱相比影响比力小。当柱过载时,大颗粒直径添补柱同小颗粒直径添补柱分散卵白和多肽的结果差未几。以是,制备色谱较常用10μm及以上颗粒直径的吸附剂。粒径散布通常都比力宽。与0.5μm或更窄的粒径散布范畴纷歧样的是,制备色谱的粒径范围更广,好比10~15μm。制备色谱柱本钱较低,以是一样平常会选择选用大粒子。

1、柱内径

由于样品存储量比力低,纯化流程不怎样利用内径低于2mm的小孔柱。大批量多肽时,利用10mm22mm内径的柱子。1mg卵白或多肽的纯化也可以接纳10mm柱子,5mg纯化可接纳22mm柱子。大批量卵白或多肽的纯化接纳50mm100mm或内径更大的大内径柱子。

2、柱长

与剖析柱比起来,制备柱通常较为短。由于在制备色谱法中,柱的总体积比柱长更为紧张,尤其是卵白的分散。

内径60cm、柱长12-15cm(“圆饼状”柱)的色谱柱已运用在卵白的大范围纯化中。由于在制备色谱法中,柱通常过载,且收益的紧张水平比不上总产量、纯度及通量紧张,以是依照实在用代价而不是经济效益改良柱尺寸。

纯化时,柱严峻过载招致峰变宽

3、活动相构成

与剖析色谱法相反,利用10~22mm内径柱的较小范围纯化较常用乙腈-TFA系统。大范围的纯化一样平常利用乙醇等溶液代替乙腈,选用乙酸取代TFA。固然选用这种溶剂作活动相会低落辨别率,但它们愈加合适大范围的使用,且辨别率的降落与柱过载既有的辨别率侵害分歧

4、卵白变性

广泛以为反相色谱可以让卵白变性,以是洗脱得出来的卵白并非自然卵白,且很有大概没有生物活性。即便反相HPLC的操纵要求会让卵白变性,但洗脱后仍然可以取得自然、具有生物活性的卵白。

基于二硫键的作用,卵白维持球形结构,且只呈现部分去折叠,以是从反相柱洗脱出来的卵白每每可经过在适当的重折叠缓冲液中处置,进而回复复兴其自然布局而规复至tian然形态。

许多案例表现接纳反相HPLC纯化之后的卵白仍坚持自然三级布局和生物活性。胰卵白酶的反相纯化,当中活性失掉了保存,且紧接着用来卵白的胰卵白酶酶切。

 

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